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技術(shù)文章
蛋白免疫印跡（WB）是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測(cè)特定樣品或提取物中某種特定蛋白的方法。聚丙烯酰胺凝膠緊貼著膜放置，常用的膜是硝酸纖維素或PVDF（聚偏乙烯氟化物），在電流的作用下蛋白質(zhì)從凝膠遷移到膜上并且被固定。膜是凝膠蛋白質(zhì)的復(fù)制品，然后可以與抗體結(jié)合后進(jìn)行染色。免疫印跡（WB）是一項(xiàng)通過凝膠電泳按照分子量大小分離蛋白，然后再利用特異性抗體識(shí)別這些蛋白的技術(shù)。它是對(duì)蛋白進(jìn)行定性和相對(duì)定量的重要檢測(cè)工具。
您在WB實(shí)驗(yàn)時(shí)是否遇到無信號(hào)、高背景、多帶等問題？小編接下來將一一為您呈現(xiàn)這些問題的常見原因和解決方案。
Chapter1
無信號(hào)常見原因和解決方案
WB實(shí)驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)無信號(hào)或信號(hào)弱現(xiàn)象，小艾歸納整理發(fā)現(xiàn)，主要是靶標(biāo)自身特性和WB實(shí)驗(yàn)流程中的樣本制備、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、洗膜和檢測(cè)等具體實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)問題會(huì)導(dǎo)致這一現(xiàn)象。接下來小艾跟大家詳細(xì)扒一扒具體細(xì)節(jié)有哪些。
1.靶點(diǎn)特性導(dǎo)致無信號(hào)的常見原因及解決方案
▼ 組織或細(xì)胞中靶標(biāo)蛋白含量低導(dǎo)致無信號(hào)或信號(hào)弱
可通過如下建議解決：
參考文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)（例如The Human Protein Atlas）等，確認(rèn)靶標(biāo)蛋白是否在待檢組織或細(xì)胞中表達(dá)。我們總結(jié)了41個(gè)有表達(dá)特異性的熱門靶標(biāo)表達(dá)信息，供大家參考（附錄1）。
增加上樣量，至少上樣20-30μg蛋白。
濃縮使信號(hào)大化（例如檢測(cè)核蛋白要用核裂解物；檢測(cè)膜蛋白用膜裂解液，超速離心分離膜蛋白）。我們總結(jié)了58個(gè)熱門靶標(biāo)亞細(xì)胞定位信息，及其陽性對(duì)照供大家參考（附錄2）。
參考文獻(xiàn)或產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)增加靶標(biāo)蛋白表達(dá)。很多靶標(biāo)蛋白需要藥物誘導(dǎo)或其它特殊處理，其含量才能達(dá)到WB檢測(cè)范圍，我們整理了17個(gè)熱門靶標(biāo)蛋白在不同細(xì)胞系中藥物處理信息，及對(duì)應(yīng)產(chǎn)品供大家參考（附錄3）。
選擇確認(rèn)表達(dá)靶標(biāo)蛋白的樣本作為陽性對(duì)照（可參考產(chǎn)品說明書中提供的陽性對(duì)照）。
附錄1 熱門靶標(biāo)蛋白表達(dá)及陽性對(duì)照
靶標(biāo)名稱 | 組織/細(xì)胞表達(dá)特異性（Uniprot） |
Alpha-synuclein | •Alpha-synuclein主要在大腦中表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前末梢高度表達(dá)。 |
•在除肝臟外的組織中也有少量表達(dá)。 | |
BDNF | •BDNF在海馬、杏仁核、大腦皮層和小腦等腦組織中高度表達(dá)。 |
•BDNF也表達(dá)于心臟、肺、骨骼肌、睪丸、前列腺和胎盤中。 | |
Caspase-3 /cleaved Caspase-3 | •在肺、脾、心臟、肝臟和腎臟中高度表達(dá)。 |
•腦和骨骼肌內(nèi)中水平表達(dá)，睪丸低水平表達(dá)。 | |
•在許多細(xì)胞系中表達(dá)，在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)最高。 | |
?點(diǎn)擊此處查看更多熱門靶標(biāo)組織/細(xì)胞表達(dá)特異性 | |
附錄2 熱門靶標(biāo)蛋白亞細(xì)胞定位及陽性對(duì)照
靶標(biāo)名稱 | 蛋白亞細(xì)胞定位（Uniprot） | 陽性對(duì)照 |
Alpha-synuclein | 細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核；也分泌于細(xì)胞連接、突觸和多巴胺能神經(jīng)元膜結(jié)合處。 | •WB：HAP1、HEK293-T細(xì)胞裂解液 ；人、大鼠腦組織裂解液 ；重組人Alpha-synuclein蛋白（?ab51189） 。 |
BDNF | 分泌型 | •WB：重組人/小鼠/大鼠BDNF蛋白（?ab9794） ；人，大鼠和小鼠的腦，海馬和小腦組織裂解液 |
BrdU | 細(xì)胞核 | •IHC：來自BrdU 處理的小鼠的未染色切片(?ab129956)。 •ICC：BrdU處理的HeLa 細(xì)胞。 |
附錄3 熱門靶標(biāo)蛋白陽性對(duì)照及藥物處理?xiàng)l件
靶標(biāo)名稱 | 細(xì)胞系 | 試劑處理 | 產(chǎn)品 |
c-Fos | HeLa | 血清饑餓36小時(shí)，20% FBS（2小時(shí)） | ?ab214672 |
Jurkat | 血清饑餓過夜，PMA（200 nM， 4 小時(shí)） | ||
RAW 264.7 | 血清饑餓過夜，PMA（200 nM， 4 小時(shí)） | ||
Cleaved Caspase-3 | HAP1 | 星形孢菌素（2 μM， 24小時(shí)） | ?ab32042 |
HeLa | 星形孢菌素（2 μM， 24小時(shí)） | ||
cleaved N-terminal DFNA5 / GSDME | SH-SY5Y | Etoposide（60 μM ，14小時(shí)） | ?ab222408 |
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▼組織或細(xì)胞中修飾后（磷酸化、乙?；头核鼗龋┑陌袠?biāo)蛋白含量底，可導(dǎo)致無信號(hào)或信號(hào)弱現(xiàn)象
可通過如下建議解決：
通常情況下，在未處理的組織或細(xì)胞中，大部分翻譯后修飾狀態(tài)下的蛋白含量較少。
參考文獻(xiàn)或產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)增加靶標(biāo)蛋白含量。我們整理了25個(gè)熱門靶標(biāo)，在不同細(xì)胞系中檢測(cè)其翻譯后修飾形式，需藥物處理?xiàng)l件及對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品，供大家參考（附錄3）。
裂解緩沖液中使用相應(yīng)去修飾酶抑制劑。（例如靶蛋白磷酸化檢測(cè)，裂解液中需增加磷酸酶抑制劑）
陽性對(duì)照（參考產(chǎn)品說明書中誘導(dǎo)試劑和條件，處理樣本。）
附錄3 翻譯后修飾靶標(biāo)蛋白陽性對(duì)照及藥物處理?xiàng)l件
靶標(biāo)名稱 | 細(xì)胞系 | 試劑處理 | 產(chǎn)品 |
eNOS(phospho S1177) | HUVEC | Pervanadate（100 uM，10分鐘） | ?ab215717 |
JAK2(phospho Y1007 + Y1008) | Jurkat | Pervanadate（50 mM ，5分鐘） | ?ab32101 |
C6 | Pervanadate（50 mM，5分鐘） | ||
Hepa1-6 | Pervanadate（100 µM，30分鐘） | ||
MEF | Pervanadate（100 µM，30分鐘） | ||
MLKL(phospho S345) | L-929 | 20 ng/ml TNF alpha，100 nM Smac mimetic和20 µM z-VAD（8小時(shí)） | ?ab196436 |
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注：具體細(xì)胞系處理信息請(qǐng)參考產(chǎn)品說明書
▼靶標(biāo)蛋白是分泌型蛋白，檢測(cè)時(shí)分泌到細(xì)胞外，若檢測(cè)的樣本為全細(xì)胞裂解液，會(huì)出現(xiàn)無信號(hào)或信號(hào)弱現(xiàn)象
可通過如下建議解決：
使用 Brefeldin A（BFA）抑制蛋白分泌，提取全細(xì)胞裂解液。
如果全細(xì)胞裂解液中檢測(cè)不到靶蛋白，建議提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白。
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